熒光顯微鏡原理特點(diǎn)與使用

(一)熒光顯微鏡的基本原理和結(jié)構(gòu)特征：熒光顯微鏡是運(yùn)用一個(gè)高發(fā)光效率的線光源，通過正片疊底系統(tǒng)軟件傳出一定波長(zhǎng)的光(如紫外線3650入或紫高清藍(lán)光4200入)做為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本里的熒光化學(xué)物質(zhì)發(fā)送出很多不同顏色熒光后，然后通過物鏡和目鏡的變大觀察。那么在明顯對(duì)襯環(huán)境下，即便熒光很薄弱也容易分辨，敏感度高，主要運(yùn)用于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能以及成分等科學(xué)研究。熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)是通過一般顯微鏡加上一些配件(如熒光燈源、激發(fā)濾片、兩色束分離設(shè)備和阻隔濾片等)的前提下所組成的。熒光燈源——般選用超高壓鈉燈(50一200W)，它可以傳出各種各樣波長(zhǎng)的光，但每一種熒光化學(xué)物質(zhì)都有一個(gè)造成熒光的激發(fā)光的波長(zhǎng)，因此要加用激發(fā)濾片（一般有紫外線、藍(lán)紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長(zhǎng)的激發(fā)光通過照射標(biāo)本上，而把別的光都吸取掉。每一種化學(xué)物質(zhì)被激發(fā)陽(yáng)光照射后，在極短時(shí)間發(fā)送出較直射光波長(zhǎng)比較長(zhǎng)的由此可見熒光。熒光具備專一性，一般都比激發(fā)光弱，為了能注意到專一的熒光，在物鏡后邊要加阻隔(或抑制)濾光片。它的功能有二：一是吸收阻攔激發(fā)光進(jìn)到目鏡、以防于擾熒光和損害雙眼，二是挑選然后讓特殊的熒光通過，表現(xiàn)出了專一的熒光顏色。二種濾光片應(yīng)該選擇搭配使用。

熒光顯微鏡從總體上激光光路來分為二種：

1．散射式熒光顯微鏡:激發(fā)燈源是由聚光鏡越過標(biāo)本原材料來激發(fā)熒光的。常見暗視野集光器，還可用一般集光器，調(diào)整后視鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射入標(biāo)本上．這也是較為老式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而主要缺點(diǎn)隨放大倍率提高其熒光變?nèi)酰虼藢?duì)觀查比較大的標(biāo)本原材料不錯(cuò)。

2．落射式熒光顯微鏡這也是近現(xiàn)代發(fā)展起來新型熒光顯微鏡，和上不一樣的地方是激發(fā)單從物鏡向降落射入標(biāo)本表層，既用同一物鏡做為照明燈具聚光器和搜集熒光的物鏡。激光光路中應(yīng)加上一個(gè)兩色束分離設(shè)備，它與光鈾呈45。角，激發(fā)光被反射面到物鏡中，并聚在試品上，試品所形成的熒光以及為物鏡鏡片表層、蓋玻片表層反射面的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反返回兩色束分離設(shè)備，使激發(fā)光和熒光分離，殘留激發(fā)光被阻隔濾片消化吸收。如換采用不同的激發(fā)濾片／兩色束分離設(shè)備／阻隔濾片的搭配插塊，可滿足不同熒光反映產(chǎn)品的必須。此類熒光顯微鏡的優(yōu)勢(shì)是視線照明燈具勻稱，顯像清楚，放大倍率越大熒光愈強(qiáng)。

（二）熒光顯微鏡操作方法．

1．開啟光源，超高壓鈉燈要加熱數(shù)分鐘才能達(dá)到高亮度。

2．散射式熒光顯微鏡需要在光源與聚光器中間安上所規(guī)定的激發(fā)濾片，在物鏡后邊安上對(duì)應(yīng)的阻隔濾片。落射式熒光顯微鏡需要在激光光路的擴(kuò)展槽中插進(jìn)所規(guī)定的激發(fā)濾片／兩色束分離設(shè)備／阻隔濾片的插塊。

3．用低倍鏡觀查，依據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)節(jié)燈源核心，使之坐落于全部照明燈具光點(diǎn)的中心。

4．?dāng)[放標(biāo)本片，變焦后就可以觀查。使用時(shí)需要注意：末裝濾光片不必保護(hù)眼睛立即觀查，以免造成眼的損害；用食油鏡觀查標(biāo)本時(shí)，務(wù)必用無(wú)熒光的獨(dú)特油鏡；高壓鈉燈關(guān)閉后不可以馬上再次開啟，須經(jīng)5min之后才能重新啟動(dòng)，不然會(huì)平穩(wěn)，危害汞燈使用壽命。

(三)觀查 在步態(tài)分析舞臺(tái)上的熒光顯微鏡下用藍(lán)紫光濾光片，由此可見經(jīng)o．01％的丫啶橙熒光染料染色細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核被激發(fā)造成二種不同顏色熒光(深綠色和橘紅色)。