光學顯微鏡的主要技術參數(shù)

在使用光學顯微鏡進行鏡檢時，人們總是希望能清晰而明亮的理想圖象，這就需要顯微鏡的各項光學技術參數(shù)達到一定的標準，并且要求在使用時，必須根據(jù)鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調各參數(shù)的關系。只有這樣，才能充分發(fā)揮顯微鏡應有的性能，得到滿意的鏡檢效果。

顯微鏡的光學技術參數(shù)包括：數(shù)值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、工作距離等等。這些參數(shù)并不都是越高越好，它們之間是相互聯(lián)系又相互制約的，在使用時，應根據(jù)鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調參數(shù)間的關系，但應以保證分辨率為準。

1． 數(shù)值孔徑

　　數(shù)值孔徑簡寫NA，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術參數(shù)，是判斷兩者（尤其對物鏡而言）性能高低的重要標志。其數(shù)值的大小，分別標刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。

　　數(shù)值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質的折射率（n）和孔徑角（u）半數(shù)的正弦之乘積。用公式表示如下：

　　　　　　　　　NA=nsinu/2

　　孔徑角又稱"鏡口角"，是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度。孔徑角越大，進入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點的距離成反比。

　　顯微鏡觀察時，若想增大NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質的折射率n值?；谶@一原理，就產(chǎn)生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質的折射率n值大于1，NA值就能大于1。

　　數(shù)值孔徑最大值為1.4，這個數(shù)值在理論上和技術上都達到了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。

　　這里必須指出，為了充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑的作用，在觀察時，聚光鏡的NA值應等于或略大于物鏡的NA值。

　　數(shù)值孔徑與其他技術參數(shù)有著密切的關系，它幾乎決定和影響著其他各項技術參數(shù)。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作距離都會相應地變小。

2． 分辨率

　　顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個物點的最小間距，又稱"鑒別率"。其計算公式是

　　　　　　　　　σ=λ/NA

    式中σ為最小分辨距離；λ為光線的波長；NA為物鏡的數(shù)值孔徑?？梢娢镧R的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。NA值越大，照明光線波長越短，則σ值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即減小σ值，可采取以下措施

　　　　　　　　?。?） 降低波長λ值，使用短波長光源。

　　　　　　　　?。?） 增大介質n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。

　　　　　　　　?。?） 增大孔徑角u值以提高NA值。

　　　　　　　　　（4） 增加明暗反差。

3． 放大率和有效放大率

　　由于經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率Γ應該是物鏡放大率β和目鏡放大率Γ1的乘積：

　　　　　　　　　Γ=βΓ1

　　顯然，和放大鏡相比，顯微鏡可以具有高得多的放大率，并且通過調換不同放大率的物鏡和目鏡，能夠方便地改變顯微鏡的放大率。

　　放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)，但也不能盲目相信放大率越高越好。顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。

　　分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯(lián)系的概念。有關系式

　　　　　　　　　500NA<Γ<1000NA

　　當選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時，顯微鏡不能分清物體的微細結構，此時即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個輪廓雖大但細節(jié)不清的圖像，稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨的能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力，應使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。

4． 焦深

　　焦深為焦點深度的簡稱，即在使用顯微鏡時，當焦點對準某一物體時，不僅位于該點平面上的各點都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內，也能看得清楚，這個清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其他技術參數(shù)有以下關系：

　　　　　　　　?。?） 焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔鏡成反比。

　　　　　　　　　（2） 焦深大，分辨率降低。

　　由于低倍物鏡的景深較大，所以在低倍物鏡照相時造成困難。在顯微照相時將詳細介紹。

5． 視場直徑（Field Of View）

　　觀察顯微鏡時，所看到的明亮的圓形范圍叫視場，它的大小是由目鏡里的視場光闌決定的。視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀察。有公式 F=FN/β式中F: 視場直徑，F(xiàn)N：視場數(shù)（Field Number, 簡寫為FN，標刻在目鏡的鏡筒外側），β:物鏡放大率。由公式可看出：

　　　　　　　　?。?） 視場直徑與視場數(shù)成正比。

　　　　　　　　?。?） 增大物鏡的倍數(shù)，則視場直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。

6． 覆蓋差

　　顯微鏡的光學系統(tǒng)也包括蓋玻片在內。由于蓋玻片的厚度不標準，光線從蓋玻片進入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產(chǎn)生了相差，這就是覆蓋差。覆蓋差的產(chǎn)生影響了顯微鏡的成響質量。

　　國際上規(guī)定，蓋玻片的標準厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計算在內。物鏡外殼上標的0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。

7． 工作距離WD

　　　　工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時，被檢物體應處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個概念，平時習慣所說的調焦，實際上是調節(jié)工作距離。在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。

（四） 物鏡

　　　物鏡是顯微鏡最重要的光學部件，利用光線使被檢物體第一次成象，因而直接關系和影響成象的質量和各項光學技術參數(shù)，是衡量一臺顯微鏡質量的首要標準。

　　　物鏡的結構復雜，制作精密，由于對象差的校正，金屬的物鏡筒內由相隔一定距離并被固定的透鏡組組合而成。物鏡有許多具體的要求，如合軸,齊焦。

　　　齊焦既是在鏡檢時，當用某一倍率的物鏡觀察圖象清晰后，在轉換另一倍率的物鏡時，其成象亦應基本清晰，而且象的中心偏離也應該在一定的范圍內，也就是合軸程度。齊焦性能的優(yōu)劣和合軸程度的高低是顯微鏡質量的一個重要標志，它是與物鏡的本身質量和物鏡轉換器的精度有關。

現(xiàn)代顯微物鏡已達到高度完善，其數(shù)值孔徑已接近極限，視場中心的分辨率與理論值之區(qū)別已微乎其微。但繼續(xù)增大顯微物鏡視場與提高視場邊緣成象質量的可能性仍然存在，這種研究工作，至今仍在進行。

　　　顯微物鏡與目鏡在參于成象這點上是有區(qū)別的。物鏡是顯微鏡最復雜和最重要的部分，在寬光束中工作(孔徑大)，但這些光束與光軸的傾角較小(視場小)；目鏡在窄光束中工作，但其傾角大（視場大）。當計算物鏡與目鏡，在消除象差上有很大差別。

　　　與寬光束有關的象差是球差、慧差以及位置色差；與視場有關的象差是象散、場曲、畸變以及倍率包差。

　　　顯微物鏡是一消球差系統(tǒng)。這意味著：就軸上的一對共軛點而言，消除了球差并且實現(xiàn)了正弦條件時，每一物鏡僅有兩個這種消球差點。因此，物體與象的計算位置的任何改變均導致象差變大。

1． 物鏡的主要參數(shù)

　?。?） 放大率β

　?。?） 數(shù)值孔徑NA

　　（3） 機械筒長L：在顯微鏡中，物鏡支承面到目鏡支承面之間的距離稱為機械筒長。對于一臺顯微鏡來說，機械筒長是固定的。我國規(guī)定機械筒長是160毫米。

　　（4） 蓋玻片厚度d

　?。?） 工作距離WD

  這些參數(shù)，大多刻在物鏡筒上，如圖3所示。有一種所謂筒長無限的顯微物鏡，這種物鏡的后方一般帶有輔助物鏡（也叫補償物鏡或鏡筒物鏡），被觀察物體位于物鏡前焦點上，經(jīng)過物鏡以后，成像在無限遠，再經(jīng)過輔助物鏡成像在輔助物鏡的焦平面上，如圖4所示。在物鏡和輔助物鏡之間是平行光，所以中間距離比較自由一些，可以加入棱鏡等光學元件。

2． 物鏡的基本類型

　?。?）按顯微鏡鏡筒長度（以mm計）：透射光用160鏡筒，帶0.17mm厚或更厚的蓋玻片；反射光用190鏡筒，不帶蓋玻片；透射光與反射光用鏡筒，筒長無限大。

　　（2） 按浸法特征：非浸式(干式)、浸式(油浸、水浸、甘油浸及其它浸法)。

　?。?） 按光學裝置：透射式、反射式以及折反射式。

　?。?） 按數(shù)值孔徑和放大倍數(shù)：低倍(NA≤0.2與β≤10X)，中倍(NA≤0.65與β≤40X)，高倍(NA＞0.65與β＞40X)。

    （5） 按校正象差的情況不同，通常分為消色差物鏡，半復消色差物鏡，復消色差物鏡，平視場消色差物鏡，平視場復消色差物鏡和單色物鏡。

　　　a. 消色差物鏡（Achromaticobjective）

　　　這是應用最廣泛的一類顯微物鏡，外殼上常有"Ach"字樣。它校正了軸上點的位置色差（紅，藍二色）、球差（黃綠光）和正弦差，保持了齊明條件。軸外點的象散不超過允許值(－4屬光度)，二級光譜未校正。

　　　數(shù)值孔徑為0.1~0.15的低倍消色差物鏡一般由兩片透鏡膠合在一起的雙膠物鏡構成。數(shù)值孔徑至0.2的消色差物鏡由兩組雙膠透鏡構成。當數(shù)值孔徑增大到0.3時，再加入一平凸透鏡，該平凸透鏡決定著物鏡的焦距，而其它透鏡則補償由其平面與球面產(chǎn)生的象差。高倍物鏡的平面象差可用浸法消除。高倍消色差物鏡一般均為浸式，由四部分構成：前片透鏡、新月形透鏡及兩個雙膠透鏡組。

　　　b. 復消色差物鏡（Apochromaticobjective）

　　　　這類物鏡的結構復雜，透鏡采用了特種玻璃或螢石等材料制作而成，物鏡的外殼上標有"Apo"字樣。它對兩個色光實現(xiàn)了正弦條件，要求嚴格地校正軸上點的位置色差（紅，藍二色）、球差（紅，藍二色）和正弦差，同時要求校正二級光譜（再校正綠光的位置色差）。其倍率色差并不能完全校正，一般須用目鏡補償。

　　　　由于對各種象差的校正極為完善，比響應倍率的消色差物鏡有更大的數(shù)值孔徑，這樣不僅分辨率高，象質量優(yōu)而且也有更高的有效放大率。因此，復消色差物鏡的性能很高，適用于高級研究鏡檢和顯微照相。

　　　c. 半復消色差物鏡（Semi apochromatic objective）

　　　　　半復消色差物鏡又稱氟石物鏡，物鏡的外殼上標有"FL"字樣。在結構上透鏡的數(shù)目比消色差物鏡多，比復消色差物鏡少，成象質量上，遠較消色差物鏡為好，接近于復消色差物鏡。

　　　d. 平視場物鏡（Planobjective ）

　　　　　平場物鏡是在物鏡的透鏡系統(tǒng)中增加一快半月形的厚透鏡，以達到校正場曲的缺陷，提高視場邊緣成像質量的目的。平場物鏡的視場平坦，更適用于鏡檢和顯微照相。對于平視場消色差物鏡，其倍率色差不大，不必用特殊目鏡補償。而平視場復消色差物鏡，則必須用目鏡來補償它的倍率色差。

　　　e. 單色物鏡

　　　　　這類物鏡由石英、熒石或氟化鋰制的一組單片透鏡構成。只能在紫外線光譜區(qū)的個別區(qū)內使用(寬度不超過20mm)，可見光譜區(qū)不能采用單色物鏡。這類物鏡均制成反射式與折反射式系統(tǒng)。主要缺點是相當大一部分光束在中心被遮蔽(入瞳面積的25%)。在新型折反射系統(tǒng)中，由于采用半透明反射鏡以及物鏡的膠合結構，使這一缺點大為減輕，從而可以取消反射鏡框的遮光。并且兩同軸反射鏡的殘余象差是互相補償?shù)?，同時用透鏡組來增大數(shù)值孔徑。若系統(tǒng)的校正滿意，孔徑達到NA=1.4時，中心遮蔽可不超過入瞳面積的4%。

　　　f. 特種物鏡

　　　　所謂"特種物鏡"是在上述物鏡的基礎上，專門為達到某些特定的觀察效果而設計制造的。主要有以下幾種：

　　　　　(a) 帶校正環(huán)物鏡（Correction collar objective）

　　　　　　　在物鏡的中部裝有環(huán)裝的調節(jié)環(huán)，當轉動調節(jié)環(huán)時，可調節(jié)物鏡內透鏡組之間的距離，從而校正由蓋玻片厚度不標準引起的覆蓋差。調節(jié)環(huán)上的刻度可從0 .11--.023,在物鏡的外殼上也標科有此數(shù)字，表明可校正蓋玻片從0.11-0.23mm厚度之間的誤差。

　　　　　(b) 帶虹彩光闌的物鏡（Iris diaphragm objective）

　　　　　　　在物鏡鏡筒內的上部裝有虹彩光闌，外方也可以旋轉的調節(jié)環(huán)，轉動時可調節(jié)光闌孔徑的大小，這種結構的物鏡是高級的油浸物鏡，它的作用是在暗視場鏡檢時，往往由于某些原因而使照明光線進入物鏡，使視場背景不夠黑暗，造成鏡檢質量的下降。這時調節(jié)光闌的大小，使背景變黑，使被檢物體更明亮，增強鏡檢效果。

　　　　　(c) 相襯物鏡（Phase contrast objective）

　　　　這種物鏡是由于相襯鏡檢術的專用物鏡，其特點是在物鏡的后焦平面處裝有相板。

　　　　　(d) 無罩物鏡（No cover objective）

　　　　　　有些被檢物體，如涂抹制片等，上面不能加用蓋玻片，這樣在鏡檢時應使用無罩物鏡，否則圖象質量將明顯下降，特別是在高倍鏡檢時更為明顯。這種物鏡的外殼上常標刻NC，同時在蓋玻片厚度的位置上沒有0.17的字樣，而標刻著"0"。

　　　　　(e) 長工作距離物鏡

　　　　　這種物鏡是倒置顯微鏡的專用物鏡，它是為了滿足組織培養(yǎng)，懸浮液等材料的鏡檢而設計。

（五） 目鏡

　　　目鏡的作用是把物鏡放大的實象（中間象）再放大一級，并把物象映入觀察者的眼中，實質上目鏡就是一個放大鏡。已知顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。因此，對于物鏡不能分辨出的結構，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。

（六） 聚光鏡

　　　聚光鏡裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補光量的不足和適當改變從光源射來的光的性質，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。

聚光鏡的的結構有多種，同時根據(jù)物鏡數(shù)值孔徑的大小，相應地對聚光鏡的要求也不同 。

　　　1． 阿貝聚光鏡（Abbecondenser）

　　　　　這是由德國光學大學大師恩斯特.阿貝(Ernst Abbe)設計。阿貝聚光鏡由兩片透鏡組成，有較好的聚光能力，但是在物鏡數(shù)值孔徑高于0.60時，則色差，球差就顯示出來。因此，多用于普通顯微鏡上。

　　　2． 消色差聚光鏡(Achromaticaplanatic condenser )

　　　　　這種聚光鏡又名"消球差聚光鏡"和"齊明聚光鏡"，它由一系列透鏡組成，它對色差球差的校正程度很高，能得到理想的圖象，是明場鏡檢中質量最高的一種聚光鏡，其NA值達1.4。因此，在高級研究顯微鏡常配有此種聚光鏡。它不適用于4 X以下的低倍物鏡，否則照明光源不能充滿整個視場。

　　　3． 搖出式聚光鏡（Swingout condenser）

　　　　　在使用低倍物鏡時（如4X），由于視場大，光源所形成的光錐不能充滿真整個視場，造成視場邊緣部分黑暗，只中央部分被照亮。要使視場充滿照明，就需將聚光鏡的上透鏡從光路中搖出。

4． 其它聚光鏡

　　聚光鏡除上述明場使用的類型外，還有作特殊用圖的聚光鏡。如暗視場聚光鏡，相襯聚光鏡，偏光聚光鏡，微分干涉聚光鏡等，以上聚光鏡分別適用于相應的觀察方式。

（七） 照明方法

　　　　顯微鏡的照明方法按其照明光束的形成，可分為"透射式照明"，和"落射式照明"兩大類。前者適用于透明或半透明的被檢物體，絕大數(shù)生物顯微鏡屬于此類照明法；后者則適用于非透明的被檢物體，光源來自上方，又稱""反射式照明"。主要應用與金相顯微鏡或熒光鏡檢法。

1． 透射式照明生物顯微鏡多用來觀察透明標本，需要以透射光來照明。有兩種照明方式

　　（1） 臨界照明（Criticalillumination)光源經(jīng)過聚光鏡后，成像于物平面上，如圖5所示。若忽略光能的損失，則光源像的亮度與光源本身相同，因此，這種方法相當于在物平面上放置光源。顯然，在臨界照明中，如果光源表面亮度不均勻，或明顯地表現(xiàn)出細小的結構，如燈絲等，那么就要嚴重影響顯微鏡觀察效果，這是臨界照明的缺點。其補救的方法是在光源的前方放置乳白和吸熱濾色片，使照明變得較為均勻和避免光源的長時間的照射而損傷被檢物體。用透射光照明時，物鏡成像光束的孔徑角，被聚光鏡像方光束的孔徑角所決定，為使物鏡的數(shù)值孔徑得到充分利用，聚光鏡應有與物鏡相同或稍大的數(shù)值孔徑。

　?。?） 柯拉照明臨界照明中物面光照度不均勻的缺點，在柯拉照明中可以消除。在光源1與聚光鏡5之間加一輔助聚光鏡2，如圖6所示。可見，由于不是直接把光源，而是把被光源均勻照明了的輔助聚光鏡2（也稱為柯拉鏡）成像在標本6上，所以物鏡的視場（標本）得到均勻的照明。

2． 落射式照明

　　在觀察不透明物體時，例如通過金相顯微鏡觀察金屬磨片，往往是采用從側面或者從上面加以照明的方式。此時，被觀察物體的表面上沒有蓋玻璃片，標本像的產(chǎn)生是靠進入物鏡的反射或散射光線。如圖7所示。

3． 用暗視場來觀察微粒的照明方法用暗視場方法可以觀察超顯微質點。所謂超顯微質點，是指那些小于顯微鏡分辨極限的微小質點。暗視場照明的原理是：不使主要的照明光線進入物鏡，能夠進入物鏡成像的只是由微粒所散射的光線。因此，在暗的背景上給出了亮的微粒的像，視場背景雖暗，但襯度（對比）很好，可以使分辨率提高。

暗視場照明又有單向和雙向之分

　?。?） 單向暗視場照明 圖8是單向暗視場照明示意圖。由圖可見，由照明器2發(fā)出的光線，經(jīng)不透明的標本片1反射后，主要的光線都沒有進入物鏡3，進入物鏡的光線主要是由微粒或凸凹不平的細部所散射的光線。顯然，這種單向的暗視場照明，對觀察微粒的存在和運動是有效的，但對物體細節(jié)的再現(xiàn)不是有效的，即存在"失真"的現(xiàn)象。

　?。?） 雙向暗視場照明