共聚焦顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的對比

共聚焦顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的對比

顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，后者則以電子束為光源。普通光學(xué)顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡同屬于光學(xué)顯微鏡。

一、普通光學(xué)顯微鏡

普通生物顯微鏡由3部分構(gòu)成，即：①照明系統(tǒng)，包括光源和聚光器；②光學(xué)放大系統(tǒng)，由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，為了消除球差和色差，目鏡和物鏡都由復(fù)雜的透鏡組構(gòu)成；③機械裝置，用于固定材料和觀察方便。

顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的分辨力（resolution）有關(guān)，分辨力是指顯微鏡（或人的眼睛距目標25cm處）能分辨物體最小間隔的能力，分辨力的大小決定于光的波長和鏡口率以及介質(zhì)的折射率，用公式表示為：

R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2

式中：n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標本對物鏡鏡口的張角），N.A.=鏡口率（numeric aperture）。鏡口角總是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。

制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。對于干燥物鏡來說，介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。

普通光線的波長為400~700nm，因此顯微鏡分辨力數(shù)值不會小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設(shè)計的最大放大倍數(shù)通常為1000X。

二、激光共聚焦掃描顯微境

激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope），用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。由于激光束的波長較短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機內(nèi)，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。

為什么需要共聚焦顯微鏡?

1.光學(xué)顯微鏡經(jīng)過了我們偉大的前人們的努力與改良，已經(jīng)臻于完善的地步。事實上，通常的顯微鏡可以簡單、快捷地為我們提供美麗的微觀圖像。但是，給這個近乎完善的顯微鏡世界帶來革命性創(chuàng)新的事件發(fā)生了，這就是“激光掃描型共聚焦顯微鏡”的發(fā)明。這種新型顯微鏡的特點是：采用僅將焦點所集中的面上的圖像情報提取出來的光學(xué)系統(tǒng)，通過改變焦點的同時將所獲得的信息在圖像存儲器內(nèi)復(fù)原，從而可以獲得具有完全3維信息情報的鮮明的圖像。通過這個方法，可以簡單地獲得以通常的顯微鏡所無法確認的、關(guān)于表面形狀的信息。另外，對于通常的光學(xué)顯微鏡來說，“提高分辨率”與“加深焦點深度”是相互矛盾的條件，尤其在高倍率時這個矛盾更為突出，但在共聚焦顯微鏡來講，這個難題迎刃而解。

2.共聚焦光學(xué)系統(tǒng)的優(yōu)勢

激光共焦顯微鏡原理圖

共聚焦光學(xué)系統(tǒng)是對樣品進行點照明，同時反射光也采用點感受器來受光。樣品被放置在焦點位置時，反射光幾乎全部可以到達感光器，樣品偏離焦點時，反射光無法到達感光器。也就是說，共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，只有與焦點重合的圖象會被輸出，光斑、無用的散亂光都被屏蔽掉了。

3.為何用激光？

共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，對樣品進行點照明、同時反射光亦采用點感光器受光。因此，點光源就成為必要。激光屬于非常優(yōu)秀的點光源。大多數(shù)情況下，共聚焦顯微鏡的光源都采用激光光源。另外，激光所具有的單色性、方向性以及優(yōu)異的光束形狀等特征，也是被廣泛采用的重要理由。

4.高速掃描基礎(chǔ)上的實時觀察成為可能

激光的掃描，其水平方向采用了聲控光學(xué)偏向單元（Acoustic Optical Deflector，AO素子）、垂直方向采用了伺服電控光束掃描鏡（Servo Galvano-mirror）。音響光學(xué)偏向單元由于不存在機械性震動部分，所以可以進行高速的掃描，在監(jiān)視畫面上實時觀察成為可能。這種攝像的高速性，是直接影響聚焦、位置檢索速度的非常重要的項目。

5.焦點位置和亮度的關(guān)系

共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，樣品被正確地放置在焦點位置時亮度為最大，在它的前后，其亮度皆會銳減（圖4實線）。這種焦點面的敏感的選擇性，也正是共聚焦顯微鏡高度方向測定以及焦點深度擴張的原理所在。相對于此，通常的光學(xué)顯微鏡則在焦點位置前后不會有明顯的亮度變化（圖4點線）。

6.高對比度、高分辨率

通常的光學(xué)顯微鏡，由于偏離焦點部分的反射光會發(fā)生干擾，它與焦點成像部分發(fā)生重疊，從而造成圖像對比度的降低。而相對于此，共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，焦點以外的散亂光以及物鏡內(nèi)部的散亂光幾乎完全被去除掉，因而可以獲得對比度非常高的圖像。另外，由于光線2次通過物鏡使得點像更加先銳化，也提高了顯微鏡的分辨能力。

7.光學(xué)局部化功能

共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，與焦點重合點以外的部分的反射光被微孔屏蔽掉了。因此在觀察立體樣品時，形成如同用焦點面對樣品進行切片后形成的圖象（圖5）。這種效果被稱為光學(xué)局部化，屬于共聚焦光學(xué)系統(tǒng)的特長之一。

8.焦點移動記憶機能

所謂焦點以外的反射光被微孔屏蔽掉，反過來看的話，可以認為共聚焦光學(xué)系統(tǒng)所成的像上所有的點均與焦點重合。因此將立體樣品沿Z軸（光軸）方向移動的話，將圖像累積保存在存儲器內(nèi)，最終就會獲得樣品全體與焦點重合而形成的圖像。以這種方法將焦點深度無限加深的機能稱做移動記憶機能。

9.表面形狀測定機能

焦點移動機能上，追加以面的高度記錄回路，就可以對樣品的表面形狀進行非接觸式測定。以此機能為基礎(chǔ)，對各畫素中最大輝度值形成的Z軸坐標的記錄成為可能，并以此情報為依據(jù)可以獲得樣品表面形狀相關(guān)的情報。

10.高精度微小尺寸測定機能

受光單元采用了1維CCD成像傳感器，因此可以不受掃描裝置掃描傾斜等的影響，從而可以完成高精度的測定。另外，由于同時采用焦點深度可調(diào)（加深）的焦點移動記憶機能，從而可以剔除由于焦點偏移而造成的測定誤差。

11.三維圖像解析

使用表面形狀測定機能，可以輕松地做出樣品表面三維圖像。不僅如此，還可以進行多種解析如：表面粗糙度測定、面積、體積、表面積、圓形度、半徑、絕對最大長度、周長、重心、斷層圖像、FFT變換、線幅測定等等。

激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態(tài)，也可以用于細胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)的測量。