熒光顯微鏡的工作原理

熒光顯微鏡的工作原理

熒光顯微鏡是不太常見的顯微鏡，下面上海巴拓儀器有限公司向大家介紹一下熒光顯微鏡的原理。

熒光顯微鏡原理：

    在一百年前，斯托克（STOKES)發(fā)現(xiàn)自然界有許多物質能在較短波長光線照射下，發(fā)出較長波長的光線，也即這些物質在被紫外光、紫光、蘭光或綠光照射后，能激發(fā)出藍色、綠色、黃色或紅色的熒光，叫做光致熒光。

    于是在1911年奧地利科學家K.Reichert 第一次制成有實用價值的熒光顯微鏡，采用碳弧燈作激發(fā)光源，用液體濾光器分離出所需紫外光，采用普通顯微鏡進行觀察。

    當時熒光顯微術對植物學及礦物學利用初級熒光即可獲得良好的分析效果，但對于人及動物的內科研究則不能采用，因為人及動物的初級熒光太弱。

    在1933年，M.Haitinger發(fā)現(xiàn)第二次熒光，把標本經過熒光染色處理后，再用短波光線激發(fā)，獲得較強熒光以適應對人及動物的研究。

    免疫學的重要對象是抗原和抗體的反應問題，由于抗原抗體反應的高度特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反應時，只要知道其中一個因子，也就知道了另一個因子，用普通染料來使抗體（或抗原）著色，由于被視覺所能感知的染料分子的數(shù)量比較大，往往破壞了抗原或抗體的特異活性而不能達到目的。

    熒光染料它本身是作為一個發(fā)射體而顯現(xiàn)顏色，可在黑暗背景下觀察，對人的視覺有高度靈敏性，只需極微量光線就可在顯微鏡下被感知，這就使熒光染料成為一種合適的標記物，它既能使被標記的抗體保持原有的特異活性，又能在熒光顯微鏡下被肉眼覺察。

    熒光標本制作過程是將抗原固定在玻片上，然后用熒光抗體（熒光染料與抗體相結合)染色一定時間，以水沖洗，如抗原抗體發(fā)生反應造成結合，則抗體固定在抗原上，否則被水沖去，最后在熒光顯微鏡下觀察結果。

    每一種細菌都有自己的特異抗原，因此，在原則上，應用充分的特異的熒光抗體，可以從血清學上鑒定任何一種細菌。

    由于熒光染色的色素只需極稀的濃度便能激發(fā)出明亮的熒光，一般對機體是無害的，因而為活體觀察，如研究功能器官的過程和微細結構，某些代謝變化的過程等，提供了廣泛的可能性，另外，熒光色素染色法非常簡單，需時短，標本制作容易，特別適合于快速工作，如傳染病的快速診斷等。

以下為激發(fā)熒光時的原理圖：

1. 光源——它提供激發(fā)熒光所需要的足夠強的激發(fā)光（較短波長光線），通常它是超高壓汞燈(HBO200, HBO100或B050)。采用藍光激發(fā)時（FITC)也可用溴鎢燈。

2. 激發(fā)濾光片——它只通過相應標本所需要的激發(fā)光，而不需要的光線都遏止掉。

3. 熒光標本——被熒光色素染色過的標本。

4. 遏止濾光片——它遏止掉多余的激發(fā)光線，通過標本中激發(fā)出來的熒光，便于觀察