顯微鏡成像系統(tǒng)的選擇方法

顯微鏡成像系統(tǒng)的選擇方法

為什么需要在顯微鏡中加入成像系統(tǒng)？因?yàn)殡S著時(shí)代的進(jìn)步發(fā)展，普通的光學(xué)顯微鏡已經(jīng)不能滿足人們對(duì)微觀世界的探索了，隨著電腦型三目顯微鏡，數(shù)碼型三目顯微鏡的出現(xiàn)，很多人放棄傳統(tǒng)的普通光學(xué)顯微鏡，電腦型三目顯微鏡不但能同時(shí)多人一起觀察，還可以拍攝成圖像，仔細(xì)分析研究。那么問(wèn)題就來(lái)了，怎么選擇合適的顯微鏡的攝像頭呢？現(xiàn)在就由上海巴拓儀器有限公司向各位介紹一下：

    在感光膠片之外，人們可以通過(guò)電子電路捕捉圖像，這些以數(shù)字形式存在的圖像更加易于處理和分發(fā)。數(shù)字圖像已經(jīng)成為許多研究領(lǐng)域中不可替代的重要工具。

    數(shù)碼成像技術(shù)應(yīng)用到顯微鏡上，以替代以往的膠卷拍攝，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用了。以前我們用膠卷來(lái)進(jìn)行顯微拍攝，要等一卷拍完，沖洗出來(lái)才能確定拍攝的圖像是否清晰，如果拍攝的圖像不理想，而顯微觀察的樣品又失效了，就需要重新制作樣品，給研究工作帶來(lái)很大的不便，而現(xiàn)在使用顯微鏡攝像頭來(lái)拍攝顯微圖像，所見(jiàn)即所得，當(dāng)時(shí)就是保存處理，甚至統(tǒng)計(jì)分析，極大的提高了工作效率。

顯微鏡攝像頭的組成：

    顯微鏡攝像頭包括 CCD / CMOS 專業(yè)相機(jī)，圖像采集處理軟件，顯微鏡接口，數(shù)據(jù)傳輸線等，其中最核心的設(shè)備是 CCD 和 CMOS 圖像傳感器，前者由光電耦合器件構(gòu)成，后者由金屬氧化物器件構(gòu)成。兩者都是光電二極管結(jié)構(gòu)感受入射光并轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，主要區(qū)別在于讀出信號(hào)所用的方法。

    CCD (Charge Coupled Device ，感光耦合組件)上感光組件的表面具有儲(chǔ)存電荷的能力，并以矩陣的方式排列。當(dāng)其表面感受到光線時(shí)，會(huì)將電荷反應(yīng)在組件上，整個(gè) CCD 上的所有感光組件所產(chǎn)生的信號(hào)，就構(gòu)成了一個(gè)完整的畫(huà)面。

    CCD 的結(jié)構(gòu)分三層 ，第一層“微型鏡頭”“ON-CHIP MICRO LENS”，這是為了有效提升 CCD 的總像素，又要確保單一像素持續(xù)縮小以維持 CCD 的標(biāo)準(zhǔn)面積，在每一感光二極管上(單一像素)裝置微小鏡片。

    CCD 的第二層是“分色濾色片”，目前有兩種分色方式，一是RGB原色分色法，另一個(gè)則是CMYG補(bǔ)色分色法。原色 CCD 的優(yōu)勢(shì)在于畫(huà)質(zhì)銳利，色彩真實(shí)，但缺點(diǎn)則是噪聲問(wèn)題。

    第三層：感光層，這層主要是負(fù)責(zé)將穿過(guò)濾色層的光源轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)，并將信號(hào)傳送到影像處理芯片，將影像還原。

    數(shù)碼成像的核心器件除 CCD ,現(xiàn)在越來(lái)越多的使用 CMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor，互補(bǔ)性氧化金屬半導(dǎo)體， CMOS 和 CCD 一樣同在數(shù)碼相機(jī)中可記錄光線變化的半導(dǎo)體。 CMOS 傳感器中每一個(gè)感光元件都直接整合了放大器和模數(shù)轉(zhuǎn)換邏輯，當(dāng)感光二極管接受光照、產(chǎn)生模擬的電信號(hào)之后，電信號(hào)首先被該感光元件中的放大器放大，然后直接轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的數(shù)字信號(hào)。 CMOS 的優(yōu)勢(shì)在于成本低，耗電需求少，便于制造， 可以與影像處理電路同處于一個(gè)芯片上，缺點(diǎn)是較容易出現(xiàn)雜點(diǎn)。

顯微鏡攝像頭相關(guān)參數(shù)：

    對(duì) CCD / CMOS 數(shù)碼成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和原理有了一個(gè)基本了解后，我們?cè)賹?duì)成像系統(tǒng)的一些基本參數(shù)作一個(gè)說(shuō)明。在實(shí)際應(yīng)用中，很多用戶對(duì)像素多少很敏感，一上來(lái)就提到我要多少萬(wàn)像素的成像系統(tǒng)，其實(shí)在專業(yè)成像應(yīng)用中，像素多少只是影響成像的一個(gè)因素，還有其他很多指標(biāo)，包括分辨率，感光器件大小，動(dòng)態(tài)范圍,靈敏度，量子效率，信噪比等。

    感光器件的面積大小是衡量顯微鏡攝像頭質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，感光器件的面積越大，捕獲的光子越多，感光性能越好，信噪比越低。當(dāng)前數(shù)碼成像系統(tǒng)中較常應(yīng)用的感光器件規(guī)格如下：1英寸（靶面尺寸為寬12.7mm*高9.6mm，對(duì)角線16mm），2/3英寸， 1/2英寸，1/3英寸，另外有時(shí)也用到1/1.8英寸,1/2.5英寸的 CCD / CMOS 感光器件。

    像素是 CCD / CMOS 能分辨的最小的感光元件，顯微鏡攝像頭的像素由低到高有：

   45萬(wàn)左右，140萬(wàn)左右，200萬(wàn)左右，300萬(wàn)左右，500萬(wàn)左右，900萬(wàn)像素，甚至還有更高的達(dá)到2000萬(wàn)像素以上。

    一般來(lái)說(shuō)，像素越高，圖像分辨率越高，成像也就越清晰，但有時(shí)候圖像分辨率達(dá)到一定程度后，就不是影響成像質(zhì)量的主要指標(biāo)了。

    比如圖像分辨率高，噪聲也很高時(shí)，成像質(zhì)量也不會(huì)很好。暗電流是導(dǎo)致 CCD 噪音的很重要的因素。暗電流指在沒(méi)有曝光的情況下，在一定的時(shí)間內(nèi)， CCD 傳感器中像素產(chǎn)生的電荷。

    我們?cè)谧鰺晒馀臄z的時(shí)候，需要的曝光的時(shí)候比較長(zhǎng)，這樣導(dǎo)致 CCD 產(chǎn)生較多的暗電流，對(duì)圖像的質(zhì)量影響非常大。通常情況下通過(guò)降低 CCD 的溫度來(lái)最大限度的減少暗電流對(duì)成像的影響。Peltier制冷技術(shù)一般可將 CCD 溫度降低5-30°C，在長(zhǎng)時(shí)間拍攝或一次曝光超過(guò)5-10秒， CCD 芯片會(huì)發(fā)熱，沒(méi)有致冷設(shè)備的芯片，“熱”或者白的像素點(diǎn)就會(huì)遮蓋圖像，圖像會(huì)出向明顯的雪花點(diǎn)。

    CCD 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、數(shù)字化的方法等都會(huì)影響噪音的產(chǎn)生。當(dāng)然通過(guò)改善結(jié)構(gòu)、優(yōu)化方法，同樣能減少噪音的產(chǎn)生。顯微熒光或其他弱光的拍攝對(duì) CCD 噪音的降低要求很高，應(yīng)選用高分辨率數(shù)字冷卻 CCD 成像系統(tǒng)，使其能夠捕獲到信號(hào)極其微弱的熒光樣品圖像，并且能夠最大程度的降低噪音，減少背景，提供出色的圖像清晰度。所以一般在熒光及弱光觀察時(shí)需要選擇制冷 CCD 。

    在顯微數(shù)碼成像過(guò)程中，對(duì)于熒光及弱光的拍攝，除了制冷降低熱噪聲外，還可使用提高圖像的靈敏度，像素合并是一種非常有用的功能，它可被用來(lái)提高像素的大小和靈敏度，比如攝像頭像素大小為5u,當(dāng)經(jīng)過(guò)2x2合并后，像素大小為10u，3X3合并后，像素大小為15u, 這是圖像的整體像素變少了，但成像的靈敏度可提高9倍。

    動(dòng)態(tài)范圍表示在一個(gè)圖像中最亮與最暗的比值。12bit表示從最暗到最亮等分為212＝4096個(gè)級(jí)別，16bit即分為216個(gè)級(jí)別，可見(jiàn)bit值越高能分出的細(xì)微差別越大，一般 CMOS 成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)范圍具有8-10bit, CCD 以10-12bit為主，少部分可達(dá)16bit。對(duì)動(dòng)態(tài)范圍進(jìn)行量化需要一個(gè)運(yùn)算公式，即動(dòng)態(tài)范圍值 = 20 log (well depth/read noise)，動(dòng)態(tài)范圍的值越高成像系統(tǒng)的性能就越好。

    量子效率也稱像素靈敏度，指在一定的曝光量下,像素勢(shì)阱中所積累的電荷數(shù)與入射到像素表面上的光子數(shù)之比。不同結(jié)構(gòu)的 CCD 其量子效率差異很大。比如100光子中積累到像素勢(shì)阱中的電荷數(shù)是50個(gè)，則量子效率為50％（100 photons = 50 electrons means 50% efficiency）。值得注意的是 CCD 的量子效率與入射光的波長(zhǎng)有關(guān)。

    對(duì)顯微鏡攝像頭的參數(shù)有了整體認(rèn)識(shí)后，在實(shí)際應(yīng)用中選擇合適型號(hào)的產(chǎn)品就比較容易了。高分辨率顯微數(shù)碼成像技術(shù)在國(guó)外已有二十來(lái)年的發(fā)展歷史，產(chǎn)品目前已比較成熟